Příprava rekonstituovaných tkání

Abstract

Živé tkáně jsou vysoce dynamické systémy, v nichž neustále probíhá a mění se řada strukturálních, mechanických, biochemických a biologických podnětů v rámci trojrozměrné struktury. Buňky a tkáňové scaffoldy (extracelulární matrix) hrají rozhodující a synergickou roli nejen při tvorbě architektury tkáně, ale také při udržování její fyziologické funkce. Proto musí být při přípravě rekonstituovaných tkání splněna úloha jak buněk, tak i scaffoldů. Jedná se o dynamickou, multidisciplinární oblast výzkumu, kde jsou modely v závěru použitelné pro tkáňové inženýrství a regenerativní medicínu, modelování nemocí a případné experimenty in vitro. V rámci práce je hlavní pozornost věnována rekonstituovaným trojrozměrným (3D) modelům kůže. Modely by tedy měly umožnit rekonctituci architektury kožní tkáně a jejího mikroprostředí, umožnit zkoumání interakce buňka-matrix a mezi různými typy kožních buněk, a koneckonců i funkci a fyziologii kožní tkáně in vivo. Cílem práce je objasnit přípravu kolagenové vrstvy a následné zajištění správné ko-kultivace fibroblasty-keratinocyty s výsledkem vytvořeného plně funkčního kožního ekvivalentu in vitro. Bez ohledu na to mohou být buňky kožní tkáně, respektive dermální fibroblasty, použity jako scaffoldy extracelulární matrix samosestavené z fibroblastových buněk (CAM). Tato metodika využívá vlastní schopnost buněk produkovat vlastní extracelulární matrix (ECM), místo použití syntetických nebo přírodních materiálů jako scaffold. CAM scaffold může být vytvořen a řízen i vnějšími faktory, jako je mechanická stimulace. V této práci byly kultivovány lidské kožní fibroblasty za podmínek in vitro s kyselinou askorbovou, podporující tvorbu ECM. Výsledkem je neporušená ECM, která zachovává složení a strukturu původní tkáně a zároveň vykazuje vylepšené vlastnosti pro řízení buněčného chování, například anizotropii. Přestože CAM dokáže věrně napodobit biochemické a základní strukturu ECM, postrádá plnou hierarchickou složitost a mechanické vlastnosti přirozené tkáně. Tyto instruktivní vlastnosti buněk poté ovlivňují kvalitu a funkčnost CAM scaffoldů a jsou utvářeny interakcemi mezi buňkami a ECM, které lze modulovat pomocí biochemických/biofyzikálních signálů pro aplikace tkáňového inženýrství. Pro studium těchto interakcí jsme vytvořili ko-kultivační platformu lidských dermálních fibroblastů a H9c2 kardiomyoblastů v různých poměrech. Tento přístup je v souladu s výsledky studií na decelularizovaných CAM, které zachovávají klíčové složky extracelulární matrix zásadní pro buněčnou adhezi a růst. CAM scaffoldy obdobně podporují proliferaci buněčné linie H9c2, poskytují plně buněčný, imunologicky bezpečný a biologicky přirozený substrát, který zlepšuje buněčné signály a umožňuje tvorbu fyziologicky relevantních tkáňových modelů.