Real Time-PCR - nástroj pro detekci a kvantifikaci mikroorganismů

Abstract

Gram negativní bakterie mohou produkovat biogenní amin putrescin např. dekarboxylací aminokyseliny L-ornithinu za katalytického působení enzymu ornithindekarboxylasy, který je kódován genem speF, nebo z L-argininu, který je dekarboxylován za katalýzy enzymem arginindekarboxylasou (kódován genem adiA), za vzniku agmatinu, který je dále metabolizován za vzniku zmíněného putrescinu. Předkládaná práce je zaměřena na sledování vlivu faktorů (změny teploty a pH) na genovou expresi sledovaných genů adiA a speF u zvolené bakterie čeledi Enterobacte-riaceae (E. coli) kultivované v reálných vzorcích nízkotučného mléka a vepřové pomazánky (paštiky). Byla optimalizována metoda izolace bakteriální RNA ze zmíněných reálných vzorků. Dále byly ověřeny funkčnosti primerů a účinnosti reakcí (real time-PCR) pro jednotlivé geny (adiA, speF, gapA /housekeeping gen/) v reálných vzorcích. Bylo potvrzeno, že reakce probíhají s dostatečnou účinností (E = 90 - 110 %) i specifičností. Vyhodnocením genové exprese metodou relativní kvantifikace dle Pfaffla bylo zjiš-těno, že pH je faktorem, který expresi genů adiA i speF zvyšuje ve všech testovaných vzorcích. Ve vzorcích bujonu byl pozorován nárůst exprese obou genů   o 25 %; ve vzorku paštiky vzrostla exprese sledovaných genů daleko významněji (  5x). Naopak teplota je faktorem, který nejen že tlumí růst bakterií, ale snižuje i expresi obou sledovaných genů (  o 70 %), tak jak se ukázalo ve vzorku bujonu s přídavkem jednotlivých aminokyselin. Lze konstatovat, že sledované geny adiA a speF jsou geny inducibilní, a že faktory jako jsou teplota, pH či dostupnost jednotlivých substrátů genovou expresi ovlivňují.